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尺寸排阻色谱法（SEC）原理
尺寸排阻色谱法（SEC）是根据样品中分子量的大小进行分离纯化的，大分子量的物质由于粒径比填料的孔径大，不能进入填料腔体内部，进而被排除在外，中分子和小分子的粒径比填料的孔径小，可以顺利的进入填料的腔体内部。而大分子不能进入填料的内部，毕竟快速的从填料之间的狭缝空隙中流出，最先流出色谱柱。而小分子物质，进入填料腔体，流动的路线更长，最迟流出色谱柱。大小分子量进而得到分离。
在做多糖、糖蛋白、蛋白研究过程中，流动相多数用水配置流动相缓冲液，使用亲水柱填料分离生物大分子，将SEC命名为凝胶渗透色谱。凝胶过滤色谱可作为用以分离生物活性物质（通常等同于在多个纯化步骤中其他的色谱技术）的前处理工具，或者亦可作为获取溶质分子信息的工具，包括分子大小或形状、聚集状态、生物聚合物与其配体结合的动力学参数。在过去凝胶渗透色谱多数采用葡聚糖、琼脂糖或者聚丙烯酰胺等软凝胶作为填料，而这些填料只能用于低压制备，不能承受太大的压力。而用于分析柱上的填料，多数是硬胶填料，单分散型，粒径小，分辨率高。可以承受几兆帕和几十兆帕的压力，或更高的压力。
SEC色谱在糖分离过程的应用
高聚多糖分子部分不能进入亲水填料的孔隙，并经颗粒间的空隙流过，淋洗出来的顺序在前；中聚多糖介于大体积分子和小分子之间；低聚寡糖和单糖体积较小的分子比凝胶颗粒的孔隙小，可以进入凝胶颗粒的空隙，并在凝胶颗粒的孔隙以及颗粒之间的空隙不断进入出来扩散，速度最慢，所以是最后被淋洗出来的。根据仪器的型号，实验流动相等条件，可以计算出保留时间或洗脱体积，可以根据普鲁兰标品推测出分子量大小。分子量越大，其淋洗体积越小，保留时间越小；子量越小洗脱体积越大，保留时间越长。
BRT® SEC色谱柱是博睿糖推出的硅胶基质的体积排阻系列色谱柱，其色谱填料为单分散、高纯度、具有良好稳定性的硅胶微球。硅胶的表面键合亲水性聚合物。博睿糖采用特殊的表面修饰手段，确保了色谱柱具有良好的稳定性和批次重现性。
不同规格BRT SEC固定相的特征参数（分析柱）
| 固定相 | SUGAR BRT-101 | SUGAR BRT-103 | SUGAR BRT-104 | SUGAR BRT-105 |
| 材料 | 纳米亲水键合材料 | 纳米亲水键合材料 | 纳米亲水键合材料 | 纳米亲水键合材料 |
| 粒径 | 5µm | 5µm | 5µm | 5µm |
| 孔径(Å) | ~ 400 | ~ 600 | ~ 800 | ~ 1,000 |
| 直径 | 4.6mm/7.8mm | 4.6mm/7.8mm | 4.6mm/7.8mm | 4.6mm/7.8mm |
| 长度 | 300mm | 300mm | 300mm | 300mm |
| 多糖分子量范围 | 1,000 - 24,000 | 11,000 - 280,000 | 48,000 - 410,000 | 400,000 - 5,000,000 |
| pH稳定性 | 4 - 7.5 (pH 9.0 下可以短暂使用) | 4 - 7.5 (pH 9.0 下可以短暂使用) | 4 - 8.5 (pH 9.0 下可以短暂使用) | 4 - 7.5 (pH 9.0 下可以短暂使用) |
| 反压(psi, 以4.6mm I.D.×300mm计) | ~ 700 | ~ 750 | ~ 750 | ~ 750 |
| 耐受压力(psi) | ~3,500 | ~ 3,000 | ~ 3,000 | ~ 3,000 |
| 氯化钠 | 50mM | 50mM | 50mM | 50mM |
| 耐受温度(°C) | ~ 80 | ~ 80 | ~ 80 | ~ 80 |
不同规格SUGAR BRT 固定相的特征参数（制备柱）
| 固定相 | SUGAR BRT-101 | SUGAR BRT-103 | SUGAR BRT-104 | SUGAR BRT-105 |
| 材料 | 纳米亲水键合材料 | 纳米亲水键合材料 | 纳米亲水键合材料 | 纳米亲水键合材料 |
| 粒径 | 10µm | 10µm | 10µm | 10µm |
| 孔径(Å) | ~ 400 | ~ 600 | ~ 800 | ~ 1,000 |
| 直径 | 20mm | 20mm | 20mm | 20mm |
| 长度 | 250mm | 250mm | 250mm | 250mm |
| 蛋白分子量范围 | 1,000 - 24,000 | 11,000 - 280,000 | 48,000 - 410,000 | 60,000 - 5,000,000 |
| pH稳定性 | 4 - 7.5 (pH 9.0 下可以短暂使用) | 4 - 7.5 (pH 9.0 下可以短暂使用) | 4 - 7.5 (pH 9.0 下可以短暂使用) | 4 - 7.5 (pH 9.0 下可以短暂使用) |
| 反压(psi, 以4.6mm I.D.×300mm计) | ~ 700 | ~ 750 | ~ 750 | ~ 750 |
| 耐受压力(psi) | ~3,500 | ~ 3,000 | ~ 3,000 | ~ 3,000 |
| 氯化钠 | 50mM | 50mM | 50mM | 50mM |
| 耐受温度(°C) | ~ 80 | ~ 80 | ~ 80 | ~ 80 |
Biomac SEC尺寸排阻色谱柱
| Biomacro SEC尺寸排阻色谱柱 | ||||
| 产品名称 | SEC100 | SEC300 | SEC500 | SEC-WR |
| 官能团 | 醇羟基 | |||
| 基质 | 聚羟基甲基丙烯酸酯 | |||
| 粒径 | 5um | |||
| 孔径 | 100Å | 300Å | 500Å | 100-500Å |
| 直径 | 4.6mm，8.0mm，20mm，50mm | |||
| 长度 | 150mm，250mm，300mm | |||
| 耐压上限 | 15Mpa | |||
| 温度上限 | 80°C | |||
| PH范围 | 2-12 | |||
| 线性范围（葡聚糖） | 1000-10,000 | 5000-400,000 | 20000-3000,000 | 2000-3000,000 |
| 应用领域 | 小分子化合物，低聚合物，多糖，糖蛋白，蛋白多糖，蛋白 | 小分子化合物，低聚合物，多糖，糖蛋白，蛋白多糖，蛋白 | 高分子聚合物，多糖，糖蛋白，蛋白多糖，蛋白 | 低聚合物，高聚多糖，糖蛋白，蛋白多糖，蛋白 |
SUGRA BRT 系列色谱柱 多糖分子量校准曲线
多糖分子量测定中串联色谱柱 SUGAR BRT-105-103-101 (4.6mm I.D. x 250 mm)
多糖分子量测定中串联色谱柱 SUGAR BRT-105-103-101 (8.0 mm I.D. x 300 mm)
多糖分子量测定中串联色谱柱 SUGAR BRT-105-103-101 (8.0 mm I.D. x 300 mm)
多糖分子量测定中3根串联色谱柱 Biomac SEC (8.0 mm I.D. x 300 mm)x3
多糖分子量测定中2根串联色谱柱 Biomac SEC (8.0 mm I.D. x 300 mm)x2
BRT® SEC色谱柱使用注意事项：
1
分子量
可根据目标物的分子量，来选择合适规格的色谱柱。
2
样品与流动相
3
离子强度
色谱柱中不可避免会存在其他次级作用力，为了最大限度降低填料与被测物的次级作用力，必须调整流动相的离子强度。NaCl是SEC分离中比较常用的盐，可通过调整离子强度，减少次级作用力，进而改善峰形和分离效果。
4
pH
流动相的pH调整，更多也是为了减少色谱柱中的次级作用对被测物的影响，所以测定过程中需选择合适的pH。为获得最佳分离效果和延长使用寿命，建议使用pH在4-7.5范围内的流动相。
5
压力
尽管BRT®SEC可在高至30Mpa 的压力下使用，但正常的操作压力应当低于15Mpa。长时间在高压下运行会损坏色谱柱和输液泵。由于压力来源于流速，因此最大流速将受制于系统所能承受的压力。一般而言，柱压会随着色谱柱使用时间的增加而逐渐增加。
6
流速
尽量采用低流速测试，可以提高分离度，进而获得更好的测试效果。内径为4.6mm和8mm的色谱柱，一般建议其正常操作流速分别为0.1-0.4mL/min和0.1-1.5mL/min。
7
柱长
通过增加色谱柱的长度可以改善SEC分离度，所以在分离过程中，在一根色谱柱达不到分离效果时，可以考虑两根或三根色谱柱串联，甚至不同孔径的色谱柱串联（注：一般大孔径的在前，小孔径的在后）。这种条件下通常也会造成出峰时间延后，及系统压力增加。
8
柱温
最高操作温度为80℃。为了获得最长的使用时间，最佳操作温度为10-40℃。长时间在高温（>80℃）下操作也会损坏色谱柱，这种情形在高的 pH（>7.5）条件下尤其突出。
9
日常维护
随着使用次数的增加，某些样品可能吸附到入口筛板或填料上。当积累到一定程度时会出现压力升高，并伴随峰形异常等现象。因此，日常使用过程中需要经常注意对色谱柱进行冲洗和维护，以达到最佳的分离效果和延长使用寿命，定期更换保护柱和在线过滤器。
10
保存
如果长时间不使用，用超纯水作为流动相，将柱子中的氯化钠置换出来，1ml/min冲洗1h，然后用100%乙腈作为流动相，1ml/min冲洗1h，然后封口保存。当再次使用时，顺序流动相置换顺序相反。乙腈的目的是防止色谱柱滋生细菌，延长色谱柱使用寿命。
BRT® SEC色谱柱使用案例：
[1] X. Tong, C. Lao, D. Li, J. Du, J. Chen, W. Xu, L. Li, H. Ye, X. Guo, J. Li, An acetylated mannan isolated from Aloe vera induce colorectal cancer cells apoptosis via mitochondrial pathway, Carbohydr Polym 291 (2022) 119464.
[2] Y. Zhou, S. Wang, W. Feng, Z. Zhang, H. Li, Structural characterization and immunomodulatory activities of two polysaccharides from Rehmanniae Radix Praeparata, Int J Biol Macromol 186 (2021) 385-395.
[3] Y. Cao, L. Zou, W. Li, Y. Song, G. Zhao, Y. Hu, Dietary quinoa (Chenopodium quinoa Willd.) polysaccharides ameliorate high-fat diet-induced hyperlipidemia and modulate gut microbiota, Int J Biol Macromol 163 (2020) 55-65.
[4] T. Guo, Y. Yang, M. Gao, Y. Qu, X. Guo, Y. Liu, X. Cui, C. Wang, Lepidium meyenii Walpers polysaccharide and its cationic derivative re-educate tumor-associated macrophages for synergistic tumor immunotherapy, Carbohydr Polym 250 (2020) 116904.
[5] Y. Han, K. Ouyang, J. Li, X. Liu, Q. An, M. Zhao, S. Chen, X. Li, X. Ye, Z. Zhao, L. Cai, W. Wang, Sulfated modification, characterization, immunomodulatory activities and mechanism of the polysaccharides from Cyclocarya paliurus on dendritic cells, Int J Biol Macromol 159 (2020) 108-116.
[6] S. Liu, Y. Yang, Y. Qu, X. Guo, X. Yang, X. Cui, C. Wang, Structural characterization of a novel polysaccharide from Panax notoginseng residue and its immunomodulatory activity on bone marrow dendritic cells, Int J Biol Macromol 161 (2020) 797-809.
[7] X. Xie, W. Shen, Y. Zhou, L. Ma, D. Xu, J. Ding, L. He, B. Shen, C. Zhou, Characterization of a polysaccharide from Eupolyphaga sinensis walker and its effective antitumor activity via lymphocyte activation, Int J Biol Macromol 162 (2020) 31-42.
[8] L. Xiu, S. Sheng, Z. Hu, Y. Liu, J. Li, H. Zhang, Y. Liang, R. Du, X. Wang, Exopolysaccharides from Lactobacillus kiferi as adjuvant enhanced the immuno-protective against Staphylococcus aureus infection, Int J Biol Macromol 161 (2020) 10-23.
[9] M. Cai, H. Xing, B. Tian, J. Xu, Z. Li, H. Zhu, K. Yang, P. Sun, Characteristics and antifatigue activity of graded polysaccharides from Ganoderma lucidum separated by cascade membrane technology, Carbohydr Polym 269 (2021) 118329.
[10] X. Chen, W. Sun, B. Xu, E. Wu, Y. Cui, K. Hao, G. Zhang, C. Zhou, Y. Xu, J. Li, H. Si, Polysaccharides From the Roots of Millettia Speciosa Champ Modulate Gut Health and Ameliorate Cyclophosphamide-Induced Intestinal Injury and Immunosuppression, Front Immunol 12 (2021) 766296.
[11] S. Shi, G. Wang, J. Liu, S. Liu, Q. Xu, X. Lan, J. Feng, J. Sun, W. Zhang, J. Wang, Gentiana straminea Maxim. polysaccharide decolored via high-throughput graphene-based column and its anti-inflammatory activity, Int J Biol Macromol 193(Pt B) (2021) 1727-1733.
[12] X. Wan, X. Li, D. Liu, X. Gao, Y. Chen, Z. Chen, C. Fu, L. Lin, B. Liu, C. Zhao, Physicochemical characterization and antioxidant effects of green microalga Chlorella pyrenoidosa polysaccharide by regulation of microRNAs and gut microbiota in Caenorhabditis elegans, Int J Biol Macromol 168 (2021) 152-162.
[13] Z.X. Wang, N. Li, J.W. Xu, Effects of Efficient Expression of Vitreoscilla Hemoglobin on Production, Monosaccharide Composition, and Antioxidant Activity of Exopolysaccharides in Ganoderma lucidum, Microorganisms 9(8) (2021).
[14] T. Xia, C.S. Liu, Y.N. Hu, Z.Y. Luo, F.L. Chen, L.X. Yuan, X.M. Tan, Coix seed polysaccharides alleviate type 2 diabetes mellitus via gut microbiota-derived short-chain fatty acids activation of IGF1/PI3K/AKT signaling, Food Res Int 150(Pt A) (2021) 110717.
[15] X. Zhang, C. Bi, H. Shi, X. Li, Structural studies of a mannoglucan from Cremastra appendiculata (Orchidaceae) by chemical and enzymatic methods, Carbohydr Polym 272 (2021) 118524.
[16] X. Zhang, Z. Liu, C. Zhong, Y. Pu, Z. Yang, Y. Bao, Structure characteristics and immunomodulatory activities of a polysaccharide RGRP-1b from radix ginseng Rubra, Int J Biol Macromol 189 (2021) 980-992.
[17] Y. Zhang, Y. Han, J. He, K. Ouyang, M. Zhao, L. Cai, Z. Zhao, W. Meng, L. Chen, W. Wang, Digestive properties and effects of Chimonanthus nitens Oliv polysaccharides on antioxidant effects in vitro and in immunocompromised mice, Int J Biol Macromol 185 (2021) 306-316.
[18] Y. Chen, Y. Ouyang, X. Chen, R. Chen, Q. Ruan, M.A. Farag, X. Chen, C. Zhao, Hypoglycaemic and anti-ageing activities of green alga Ulva lactuca polysaccharide via gut microbiota in ageing-associated diabetic mice, Int J Biol Macromol 212 (2022) 97-110.
[19] J. Fang, Y. Lin, H. Xie, M.A. Farag, S. Feng, J. Li, P. Shao, Dendrobium officinale leaf polysaccharides ameliorated hyperglycemia and promoted gut bacterial associated SCFAs to alleviate type 2 diabetes in adult mice, Food Chem X 13 (2022) 100207.
[20] X. Guan, Q. Wang, B. Lin, M. Sun, Q. Zheng, J. Huang, G. Lai, Structural characterization of a soluble polysaccharide SSPS1 from soy whey and its immunoregulatory activity in macrophages, Int J Biol Macromol 217 (2022) 131-141.
[21] N. Hu, Z. Gao, P. Cao, H. Song, J. Hu, Z. Qiu, C. Chang, G. Zheng, X. Shan, Y. Meng, Uniform and disperse selenium nanoparticles stabilized by inulin fructans from Codonopsis pilosula and their anti-hepatoma activities, Int J Biol Macromol 203 (2022) 105-115.
[22] H. Jiang, H. Zhu, G. Huo, S. Li, Y. Wu, F. Zhou, C. Hua, Q. Hu, Oudemansiella raphanipies Polysaccharides Improve Lipid Metabolism Disorders in Murine High-Fat Diet-Induced Non-Alcoholic Fatty Liver Disease, Nutrients 14(19) (2022).
[23] L. Li, W. Xu, Y. Luo, C. Lao, X. Tong, J. Du, B. Huang, D. Li, J. Chen, H. Ye, F. Cong, X. Guo, J. Li, Aloe polymeric acemannan inhibits the cytokine storm in mouse pneumonia models by modulating macrophage metabolism, Carbohydr Polym 297 (2022) 120032.
[24] Z. Ma, Q. Sun, L. Chang, J. Peng, M. Zhang, X. Ding, Q. Zhang, G. Liu, X. Liu, Y. Lan, A natural anti-obesity reagent derived from sea buckthorn polysaccharides: Structure characterization and anti-obesity evaluation in vivo, Food Chem 375 (2022) 131884.
[25] X. Li, S. Yang, S. Wang, Y. Shi, Y. Dai, X. Zhang, Y. Liu, Y. Guo, J. He, M. Xiu, Regulation and mechanism of Astragalus polysaccharide on ameliorating aging in Drosophila melanogaster, Int J Biol Macromol 234 (2023) 123632.
[26] K. Wu, Y. Li, Y. Lin, B. Xu, J. Yang, L. Mo, R. Huang, X. Zhang, Structural characterization and immunomodulatory activity of an exopolysaccharide from marine-derived Aspergillus versicolor SCAU141, Int J Biol Macromol 227 (2023) 329-339.
