项目简介：

 多糖属于结构多样化的一类大分子，单糖残基之间通过糖苷键彼此连接的。与其他生物聚合物如蛋白质和核酸相比，多糖提供最高的能力携带生物，因为它们有最大的结构潜力可变性。多糖的来源多种多样。多糖它起源于光合作用较强的植物、真菌、藻类、细菌等。在细胞水平上，多糖代表储存在细胞质中的化合物(如淀粉)，或生物膜或细胞壁的结构成分(如纤维素)。

多糖的分离、纯化基本上决定了多糖的结构特征。因此，分离纯化是多糖进行结构分析的首要核心步骤。

  该部分项目主要针对样品为粗多糖，即已经经过提取获得的粗提物，可以是热水提取乙醇沉淀、酸水解提取、碱水解提取、超声提取、酶法提取等。提取的方法这里不在赘述。

项目采用的方法：

  从本质上讲，很难清楚区分多糖分离和多糖纯化，有时多糖分离已经包含了多糖纯化，例如，在提取多糖的过程中，首先要用水来提取的，然后用碱性溶液提取。所以水溶性多糖和碱溶性多糖根据其在水/碱中的溶解度进行分离。另一方面，有时多糖纯化也包含多糖分离。例如，杂质在柱层析纯化中进一步分离。博睿糖生物在该方面具有扎实的基本功。

1）   柱色谱法

柱色谱法是是目前应用最广泛的色谱法多糖的纯化方法，由于其纯化效果好，操作简单。柱层析有以下几种方法：

①纤维素柱层析法。纤维素是很常见的柱色谱填料。首先，柱中的纤维素是用乙醇溶液平衡，然后是多糖加载在纤维素柱上进行纯化。随后，分别用淋洗液洗脱纤维素柱，从而不同的多糖组分可以依次洗脱。低分子量多糖先被洗脱，然后高分子量多糖被洗脱。在洗脱过程中，各不相同多糖组分最终可以相互分离。这个方法是所谓“分级解离法”，实质上与分级醇沉的方法相反。但该方法的缺点是流量小、耗时长。特别是对酸性多糖粘度高时，似乎流速过低。而博睿糖生物，针对该类样品具有自己独特的一套样品处理、上样和放大实验设备，很好解决以上问题。

②阴离子交换柱层析法。这是目前采用柱色谱法中最常用的多糖纯化方法。对于粗多糖溶液，通常首先采用柱层析法特别是阴离子交换柱层析方法进行分离。经此方法多糖溶液可被浓缩和得到初步纯化，部分多糖甚至可以直接获得均一多糖。到目前为止广泛使用的阴离子交换剂有DEAE-纤维素、DEAE-Sephadex和DEAE-Sepharose，其中通常以DEAE-cellulose居首选择。DEAE-纤维素具有开放的框架多糖分子可以自由进入载体并迅速扩散。博睿糖生物DE52纤维素填料（货号BRS008）是一款自主研发的专门用于多糖分离的纤维素填料，该填料具有较大的表面积。尽管它的离子交换容量仅为0.70 ~ 0.75 mmol/g，吸收DE52纤维素转化为多糖的量远大于离子交换树脂。此外，由于纤维素上的离子交换基团较少，排列松散，呈碱性，吸附能力较强DE52纤维素填料对多糖的作用较弱，为多糖可以用一定离子浓度的盐溶液洗脱。DE52纤维素填料填充后的阴离子交换柱适合于分离各种酸性多糖、中性多糖和粘多糖。阴离子交换柱色谱法可用于中性和酸性多糖的分离，以及不同中性多糖的分离。

一般而言，100g DE52纤维素填料可负重0.5-1.5 g干多糖样品。通常采用不同离子强度的缓冲液可进行梯度洗脱或逐步洗脱。除DE52-纤维素外，其他两种阴离子交换剂，即DEAE-Sephadex和DEAE-Sepharose也被广泛使用。博睿糖生物公司一般提供的多糖分离技术服务为多糖极性分离，即上述方法。

应用案例1：分离流程：洗脱曲线：

③凝胶柱层析法。凝胶柱层析是根据多糖的大小和形状进行分离多糖分子的，即分子筛的原理。这种色谱法被广泛应用于分离后多糖的纯化。一般来说，先用阴离子交换柱层析法对所得粗多糖进行初步纯化，然后再用凝胶柱层析法进一步纯化。常用的凝胶有各种类型的Sephadex, Sepharose等。淋洗液是不同浓度的盐溶液和缓冲液。博睿糖生物自主研发的全自动凝胶纯化系统（GPC Autopurifier System，BRT-GS），可实现不同分子量多糖的分离。能够实现连续进样、在线监测、重复性好，样品收集和纯化效率高。博睿糖生物公司一般提供的多糖纯化技术服务为多糖凝胶纯化，采用以上设备和上述方法。

(原理，参考文献：Molecules. 2019 Sep; 24(17): 3122)

*以下案例：两种不同分子量的多糖得到了完全分离。

*纯化前：至少2种不同分子量大小的多糖；*纯化后：对称单峰、均一多糖；

凝胶纯化前：                         凝胶纯化后：      

2）分级沉淀方法也叫分级醇沉。

这种方法的原理是不同的多糖组分在低醇或酮(通常是乙醇或丙酮)中有不同的溶解度。和分子量小的多糖相比，分子量越大的多糖其在乙醇或丙酮中的溶解度越低，所以逐渐增加乙醇或丙酮的浓度会沉淀不同分子量的多糖。常用的操作步骤如下：高浓度或无水乙醇慢慢加入多糖混合溶液中后搅拌至终乙醇浓度达到15% (v/v)。加入乙醇后放置2 h，离心取上清和沉淀(可称为“一级沉淀”)。该沉淀物为高分子量的多糖组分。继续搅拌，将乙醇缓慢加入上清液中使溶液的终乙醇浓度达到25% (v/v)。溶液静置2h后离心，得到上清液和沉淀(可称为“二级沉淀”)。第二个沉淀也是多糖组分，但其分子量低于第一沉淀物。分级沉淀过程可以进一步进行，这取决于实际情况。分级沉淀法比柱色谱法简单多了，因此该方法为研究和化妆品、保健品开发的首选方法。

3)       盐析法

该方法的原理是不同分子量的多糖组分在一定浓度的盐溶液中其溶解度不同。当一种中性盐(如NaCl、KCl、(NH4)2SO4等)添加到多糖溶液中，达到一定的浓度浓缩后，多糖馏分将作为萃取物分离出来的形式沉淀。这个多糖部分和上清可分别通过离心得到。继续将这种盐添加到得到的上清液中，因此另一个多糖馏分会沉淀出来。盐析法应用广泛用于蛋白质纯化。在前期，PSK的纯化采用该方法制备。盐析法性价比高，但其效率低，易形成共沉淀。

4)    金属协调方法

不同的多糖能与各种金属离子(铜、钡、钙、锌和铅等)形成配位化合物沉淀。这一性质也可用来分离和纯化多糖。常用的协调剂主要有CuCl2, Ba(OH)2, Pb(CH3COO)2。得到的配位化合物沉淀物首先被充分洗涤水，然后用酸分解得到游离多糖。在多糖纯化中，最常用的是铜盐与Ba(OH)2配位法。在铜盐中配合法，常用沉淀多糖试剂分别为CuCl2溶液、CuSO4溶液、Cu(CH3COO)2等。该方法步骤繁琐，且多糖有金属离子，后期结构解析有干扰而少用。