借助超高效液相串联四极杆-静 电 场 轨 道 阱 高 分 辨 质 谱 ( UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS)分析技术,采用正、负离子一、二 级全扫描模式,综合化合物一级准分子离子、二级碎 片离子等信息,确保鉴定的准确性,特结合对照 品、文献报道以及数据库多方位比对,完成中药复方的 化学成分、入血成分及组织成分特征分布快速鉴定, 以期为解析中药复方的潜在质控成分的筛选及药动学 等方面的研究提供部分参考和科学依据。
1.1 色谱条件 使用 Dionex Ultimate 3000 型超高效液相色谱 仪;流动相为 0.1%甲酸水溶液(A)-甲醇(B)为流 动相梯度洗脱,洗脱程序为 0~2 min,4% B;2~6 min,4%~12% B;6~38 min,12%~70% B;38~38.5 min,70% B;38.5~39 min,70%~95% B;39~43 min,95% B;43~45 min,4% B;体积流量 0.3 mL/min;柱温 45 ℃;进样量 3 μL。
1.2 质谱条件 使用 UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS 分析仪; 离子源(H-ESI),辅助气(N2)流量 13 arb,辅助加 热器和离子传输管温度分别为 300、320 ℃,自动 增益控制(AGC)为 1×106,射频水平(S-lens)50。正离子模式鞘气(N2)流量 35 arb,喷雾电压3.5 kV;扫描方式采用 Full MS/dd-MS2 模式,包括1 次分辨率为 70 000 FWHM 的一级全扫描和 1 次 分辨率为 17 500 FWHM 的数据依赖的二级扫描。 负离子模式鞘气(N2)流量 35 arb,喷雾电压 2.5 kV;碰撞能梯度为 10、20、40 eV,正、负离子扫 描范围为 m/z 100~1 500。
1.3 对照品溶液的制备 精密称取各对照品约 10.00 mg,置于 25 mL 量 瓶,精密加入甲醇配制成 0.40 mg/mL 的单一对照 品储备液。精密量取储备液适量,加入 20%甲醇水 溶液稀释为约 1.0 μg/mL 的混合溶液。
1.4 药液与供试品溶液的制备 5 个处方量泽泻汤共 105 g 药材,加 10 倍量 水,浸泡 30 min,煎煮 45 min,滤过,残渣加 8 倍 量水,煎煮 45 min,滤过,合并滤液,减压浓缩至 相对密度(1.20±0.10)g/cm3(60 ℃),冷冻干燥 即得干膏粉(31.5 g,收率 30.0%)。精密称取泽泻汤 干膏粉 1.0 g,于 50 mL 量瓶,加水适量,超声处理 1 h,取出,用水稀释至刻度,以 12 000 r/min 离心 15 min。将上清液过 0.22 μm 滤膜,用于质谱分析。
1.5 血清、组织样本的收集 小鼠给药前禁食 12 h,自由饮纯化水。随机分 为 3 只空白组和 9 只给药组,空白组给予等体积纯 化水,给药组按照 21 g/kg ig 每 1 mL 提取物含 1.05 g 生药(相当于 65 kg 成人 2 倍等效剂量),在给药 后 0.5、1、3 h 各处理 3 只,0.3%戊巴比妥钠麻醉 后腹主动脉取血,静止 4 h 后,在 5 000 r/min 下离 心 15 min(4 ℃)获得血清,收集肺脏、心脏、脾脏、肝脏、肾脏、回肠、脂肪,表面残留血用 0.9%生理盐水清洗,滤纸吸干,置−80 ℃保存备用。